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      蛋白酶解的首選變性劑——RapiGest SF

      放大字體  縮小字體 發布日期:2012-07-25  來源:沃特世科技(上海)有限公司實驗中心  瀏覽次數:1966
      核心提示: 蛋白酶解的首選變性劑——RapiGest SF

       
      在生物藥肽圖分析、蛋白質修飾分析、蛋白質組學研究等諸多工作中,蛋白質的變性與酶解是樣品處理的必經之路。RapiGestTM SF正是在這個實驗步驟中,用以輔助蛋白酶解的變性試劑[1,2,3]。RapiGest SF有以下優點:
      ■ 綜合水相、有機相溶液條件下,最高效的輔助酶解變性劑。
      ■ 作用過程中,不對蛋白造成副反應化學修飾。
      ■ 操作簡單、全面適應液質分析方法。
      ■ 常規操作濃度對胰蛋白酶活性無抑制。
      ■ 可大大縮短酶解反應時間。
      ■ 對各種蛋白酶、肽-N糖苷酶等多種酶解過程都適用。
       
      在蛋白質質譜分析的大部分工作中,常常需要將蛋白質酶解為多肽進行分析。但蛋白質結構是以三維結構的形式存在的,為了將蛋白高級結構內部的酶切位點暴露于蛋白酶的作用下,首先需要對蛋白進行變性,使蛋白舒展開。John R. Yates教授領導的團隊對各種變性劑中的輔助酶切效果進行了充分比較,其中RapiGest SF的表現最為(圖1[4]。仔細觀察圖1還可以發現,在實驗結果中,較為常用的尿素輔助酶切效率較差。這是由于尿素對胰蛋白酶活性的抑制作用較大。實驗人員有時會采取使用尿素進行蛋白后,將反映溶液稀釋10倍,再加入胰蛋白酶的方法,以降低尿素濃度到1M以下,減少其對胰蛋白酶的抑制。但是,面對微量的生物蛋白樣本,稀釋后的體系,會大幅度降低樣品濃度,限制了后續的分析工作。此外,尿素在對蛋白變性的過程中,還會對蛋白進行一定的化學修飾,如氨基甲;。副反應的發生對于多肽鑒定、組學水平蛋白定量會造成一定的影響與誤差。而使用RapiGest SF無副反應的問題,正常使用濃度下(0.1%)對胰蛋白酶活
      性也無影響(表1)。
      圖1. Tris水相緩沖體系下各種變性劑的輔助酶切效果比較。樣品為mammalian cell lysate cytoplasmic fraction蛋白。

      不同變性劑對胰蛋白酶活性影響對比
      檢測基于胰蛋白酶誘導N-α-苯甲酰-L-精氨酸乙基乙酯(BAEE)水解。將0.5微克胰蛋白酶加入1mL 50mM的碳酸氫銨溶液中(pH 7.9,0.2 mM BAEE)。檢測△BAEE在253 nm下的吸收值(5分鐘內的斜率)。
      RapiGest SF雖然是一種表面活性劑,但其全面適應液質分析的要求。在使用RapiGest SF作為變性劑完成蛋白酶切后,如果只進行色譜分析,則可無需對RapiGest SF進行處理。如進行液質聯用分析,則通過簡單的加酸步驟就可將RapiGest SF去除。而酸性溶液環境又恰恰是液質分析所需的樣品溶液環境。事實上,RapiGest SF是酸性不穩定表面活性劑,在酸性條件下(pH2)極易水解。RapiGestSF的結構及其水解產物見圖2。酸化后RapiGest SF降解為兩個產物:2-十二酮和3-羥(2,3-二羥基丙基)丙磺酸鈉。前者與水不能互溶,通過離心去除。后者在水溶液中溶解度很高,在反相LC模式下不保留。因此,酶消解后的水溶液可直接進行LC-MS或MALDI-MS分析。
       
      圖3為Ra piGest SF輔助的人單抗酶解的實例。通過BiopharmaLynxTM軟件分析,其序列覆蓋度為98%。而且LC/MS
      分析中沒有發現錯誤酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。2%序列未發現的原因是由于此部分序列為2個氨基酸的超短肽或單個氨基酸(R或K),其無法在反相柱上保留。
      圖 3.LC-MS分析RapiGest SF輔助下的人單抗胰蛋白酶酶解多肽。
       
      由于其表面活性劑的屬性,RapiGest SF可以非?焖俚貙Φ鞍淄瓿勺冃,從而縮短酶解實驗時間。圖4顯示,RapiGest SF輔助下,完全酶解馬肌紅蛋白只需要5分鐘。而由于肌紅蛋白屬球蛋白,其在不充分變性的情況下將難以酶解。在對照反應中,單純與胰蛋白酶孵育條件下,即使到9小時后,仍只有少量的蛋白被酶解;而使用了RapiGest SF試劑的體系,酶解效率顯著提升。
      圖 4.有無RapiGest SF輔助下,馬肌紅酶解效果對比。
       
      RapiGest SF自2002年推出以來,已經過10年的使用,它良好的性能被廣泛認可,對各種蛋白酶、肽-N糖苷酶
      等多種酶解過程都適用[5]。RapiGest SF已經成為大部分生物質譜科學家的常規必備試劑。

      參考文獻
      (1) Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. Enzyme-friendly,mass spectrometry-compatible surfactant for in-solution enzymatic digestion of proteins. Anal. Chem. 2003, 75, 6023-6028.
      (2) Huang HZ, Nic hols A, Liu DJ. Direct identification and quantification of aspartyl succinimide in an IgG2 mAb by RapiGest SF assisted digestion. Anal. Chem. 2009, 81, 1686-1692.
      (3) Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. A complete peptide mapping of membrane proteins: a novel surfactant aiding the enzymatic digestion of bacteriorhodopsin. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004, 18, 711-715.
      (4) Chen EI, Cociorva D, Norris JL, Yates JR 3rd. Optimization of Mass Spectrometry-Compatible Surfactants for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 2007, 6, 2529-2538.
      (5) Yu YQ, Gilar M, Kaska J, Gebler JC. A rapid sample preparation method for mass spectrometryc haracterization of N-linked glycans. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005, 19, 2331-2336.
       
       
      編輯:songjiajie2010

       
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      關鍵詞: 變性劑
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