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      實驗室凱氏定氮法測定牛奶中蛋白質方法的優化

      放大字體  縮小字體 發布日期:2011-01-15  來源:互聯網  瀏覽次數:7375
      核心提示:本文針對目前實驗室凱氏定氮法測定牛奶中蛋白質方法進行方法的探索優化,采用H2O2消化方法可以獲得快速而且準確的結果,而直接蒸餾法能更快的獲得結果。

      作者:Michaela Buffler
      Buchi實驗室

        歷史上很少有像牛奶這樣的食品與人類密切相關的。公元5千年前就有家養的奶牛了,而印度奶牛至今被奉為神明。牛奶的味道不僅好,而且它也是健康和營養的食品。實際上,作為最有價值的食品之一,牛奶含有構筑肌肉的健康蛋白質、強壯骨骼和牙齒的鈣、促進消化的乳糖以及強大免疫系統的維他命。牛奶蛋白質由于其含有大量的人體必須氨基酸而具有很大的價值,因此它是人體細胞(如肌肉、器官、皮膚、激素、酶)不可缺少的。
        全世界農業牛奶每年的產量是609百萬噸。最大的牛奶生產地是印度、美國和俄羅斯。歐盟(EU-15)每年生產120百萬噸;因此這也是奶制品的最大的市場。[1][2]
        全世界牛奶的消耗正日新月異的增長著(雖然主要是在奶制品消耗上)。食品企業用大量的方法處理牛奶,將之轉化為不同的產品,從奶酪、糕點以及冰淇淋生產到肉類生產或者膳食處理生產中。[3]
        由于牛奶運輸和奶牛育種值的測定對蛋白質含量有很大的影響,因此需要對其進行定期測定。
        多年以來,測定蛋白質的參考方法一直是凱氏定氮法[4]。這個方法是測定樣品中氮的含量,然后乘以特殊因子(牛奶是6.38)來計算出蛋白質的含量。
      圖1 Kjedahl K-360
                         
      然而,牛奶中也含有其它來源的氮(非蛋白氮化合物=NPN),也包括了所有這些氮,并在蛋白質含量中顯示出來。為了去除錯誤,在一些國家已經從計算總蛋白質含量到計算純蛋白質含量。

      介紹:
      牛奶中蛋白質含量
      牛奶中總蛋白質由大約94%的純蛋白質(約3.1g/100g)和約6%非蛋白質(約0.2g/100g)組成?偟鞍踪|平均含量為3.3%。
      總蛋白質
      總蛋白質由蛋白質和其它包括在計算中的非蛋白氮化合物(NPN)組成,
      純蛋白
      純蛋白由酪蛋白和乳蛋白組成。
      (純蛋白=總蛋白-NPN)
      NPN(非蛋白氮化合物)
      NPN主要由尿素和其它氮化合物(如氨基氮、多肽氮、肌氨酸、角蛋白以及銨鹽等)[5]。

      方法
        每個實驗室適用不同的標準用于他們的方法測定(使用傳統的官方建立方法如§35 LMBG, § 64LFGB, AOAC,ISO, EPA和DIN,或者其它官方沒有要求的但是可節約化學試劑、快速處理時間和保護環境的方法),這就是為什么采用從原有方法衍生出來修改過的方法的原因。
      圖2 H2O2 抽吸模塊
                           
        用H2O2 消解的凱氏過程· 用H2O2 消解法特別適用于高泡沫樣品。然而為了能夠執行此方法,需要一個特殊的抽吸模塊(圖2)來滴加H2O2。該抽吸模塊的漏斗是裝有玻璃沙芯,便于H2O2 的勻速流動。
        H2O2 消化的好處:
      ·節約50%的消化時間
      ·消化過程無泡沫
      ·無重金屬污染,保護環境
      ·用69%的硫酸替代98%的濃硫酸過程:在樣品管中加入5g 牛奶樣品,然后加入10mL H2O2(30%)和30mL 的硫酸(69%)。把H2O2 抽吸模塊放置到
      架子上。10min 消化后,再加入20mLH2O2。

      微量凱式法
        微量方法與官方方法處理方式一樣。然而,與官方方法相比,這種方法需要更小體積的樣品(1.8mL),更少的化學試劑量,消化時間也會顯著減少。
        凱氏方法過程(官方方法)
        過程:
        根據凱氏方法測定蛋白質時,牛奶樣品用濃硫酸處理,生成硫酸銨鹽。硫酸銨鹽通過與堿NaOH反應,生成氨氣,通過水蒸汽蒸餾被導入到硼酸吸收液中。然后用HCl或H2SO4滴定溶液滴定。
        NPN測定
        NPN測定的第一步就是用三氯乙酸將蛋白質沉淀。然后根據凱氏定氮法分析濾液。
        牛奶直接蒸餾法
        直接蒸餾法是一個簡單快速的測定蛋白質的方法,其省略了消化這一步。
        過程:
        取10mL牛奶樣品于樣品管中。開始蒸餾之前,加入20mL氯化鋇(10%)到樣品中,然后采用與官方方法相同的過程。
      牛奶樣品在堿性溶液中加熱,然后釋放出氨氣。由于蛋白質的組成部分谷氨酸和丙氨酸的快速水解生成大部分的氨氣。該反應過程只需幾分鐘即可完成。另外,少量的氨氣是由其它氨基酸完全分解而生成,但是這種分解速度很慢,不會影響該過程。該方法需要測定一個系數(轉換系數)以簡單地測定個氮和蛋白質含量。使用直接蒸餾方法,可以在10min內就可測定蛋白質含量。

      表1 配置

      上述儀器用于該文章中描述的應用中,也可以使用其它來自Buchi 公司的蒸餾和消解儀。

      表2 消化參數


      表3 蒸餾參數

      表4 滴定參數

      為了測定低濃度氮含量樣品(<10mg N),為了能夠更好的檢測轉折點,推薦使用低濃度的硼酸溶液(如2%,參見微量方法)。選擇適當的樣品質量/體積和滴定溶液的濃度,滴定溶液的消耗大約是5~20mL。

      表5 結果

      牛奶包裝盒上的標示以g/mL為單位,這個標示值不能直接與獲得的結果(g/g=%)做比較。因此雖然這個記過可以用于比較,但是不同的方法也可以與官方方法做比較。

      結論
      從上表可看出,優化的方法可獲得重復性好的結果。這就意味著這些方法可作為大有益處的替代方法以進行實驗室常規過程。
      所有文章中提到的方法能夠得到良好的結果。因此實驗室可以選擇適合自己要求的方法,如微量凱氏方法可以盡可能的減少化學物的使用,H2O2消化方法是為了獲得快速而且準確的結果,或者直接蒸餾法是為了盡快的獲得結果。然而,當需要強制使用官方方法(如AOAC,DIN),是不能夠使用優化方法的。

       

      編輯:songjiajie2010

       
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