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      瓷珠菌種保存法

      放大字體  縮小字體 發布日期:2017-03-10  來源:食品實驗室服務公眾號  瀏覽次數:13982
      核心提示:“瓷珠菌種保存法”網絡公開課內容。。。
       傳統的菌種保存方式簡介

      •   斜面保存法:微生物保存最基本的方法,可廣泛用于細菌、真菌等,保存期限非常短,斜面容易干裂。

      •   液體石蠟保存法:可用于保存霉菌、酵母菌、放線菌及需氧菌,方法簡便,可防止斜面干燥和氧氣進入,但一些固氮菌、分枝桿菌、毛霉、厭氧菌等不適宜用此法。

      •   甘油冷凍保存法:用于一般細菌的保存,需使甘油終濃度為20%左右,然后-20℃或-70℃以下保存。融化時需要水浴溶化。

      •   真空冷凍保存法:具有低溫、干燥、無氧的保存條件,適用于98%以上菌種的保存,但操作復雜,一般實驗室難以使用。

      •   液氮保存法:基本所有微生物均可保存,并且保存時間長,但操作較為復雜而且需要設備,不適用于一般實驗室保存菌種。

      •   沙土保存法

      •   半固體保存法

      瓷珠菌種保存法的原理

      瓷珠菌種保存管是實驗室保存菌種的容器,管內有表面凹孔小瓷珠用于細菌的吸附和保存,放置于-20℃或-80℃下便可創造干燥、低溫、缺營養的環境,使菌株處于“休眠” 狀態,方可長期保存(視不同菌種與保存溫度,一般可保存3-10 年), 同時菌種保存管的取用和保存較為便利(取用復蘇及保存菌種僅需1分鐘)。


      瓷珠菌種保存管的優點

      •      用途:菌種保存、復蘇和運輸。

      •      優點:操作簡單方便、菌種保存快速、包裝物體積小、菌種保存時間長。

      •     操作簡單方便:挑取細菌新鮮純培養物,接入菌種保存管。

      •     菌種保存快速:混勻后,吸出冷凍保存液。

      •     包裝物體積。1.8ml冷凍管。

      •     菌種保存時間長:2-8℃可保存6個月;-20℃可保存12個月;-80℃可保存24個月。



      瓷珠菌種保存管的使用方法

      菌種保存流程
      1.從培養18h以上的平板上刮去新鮮純培養物于菌種保存管中,配成大約3-4麥氏比濁度的菌懸液。
      2.擰緊保存管,來回顛倒幾次使細菌乳化,不能旋搖。
      3.用無菌移液器將菌種保存管內的液體吸取干凈,妥善放置被吸出的液體。
      4.擰緊保存管,迅速將其置于-20℃或-70℃冰箱中。
       
      使用時的注意事項

      •   被保存的菌種要求是經過純化后培養 18-24h 內的新鮮菌種(細菌18-24h,酵母菌需3 天,形成孢子的微生物保存孢子,而放線菌和絲狀真菌需培養7 天后保存),不宜使用老化或未經鑒定的菌種。

      •   菌種保存濃度必須要做3-4 麥氏比濁度,如接種濃度過低將會降低復蘇效果。

       

      •   待保存于菌種保存管中的菌種完全乳化均勻吸附在多孔小瓷珠后,要將多余的菌種保存液吸取出來并棄之,否則在復蘇時的凍融過程中會損傷菌株活性。

      •   做厭氧菌保存時,應提供厭氧的環境,如厭氧箱、厭氧袋,菌種保存管中可通入氮氣來驅除保存菌種時所引入的氧氣。菌種復蘇時,也要創造厭氧的環境。

      •   菌種復蘇完成后,對使用菌株需要進行再次純化,以保證菌株的單一性。

      常見問題答疑
       
      1、菌種保存管能保存霉菌及酵母菌嗎?
      答:可以。對于霉菌等真菌需培養7 天進行保存,而酵母菌需培養三天將孢子洗脫下來進行保存,保存管中的小瓷珠可以作為介質來吸附孢子和菌絲,相當于砂土保存法中砂土作為載體起到的作用。
      2、所有的菌都能保存嗎?如果不是的話,什么樣的菌可以保存?什么樣的菌不可以保存?
      答:可以。菌種保存的原理是預防或減緩DNA 復制時自發突變導致菌種退化,因此要創造代謝不活潑的狀態,而菌種保存時使菌種進入休眠態(孢子、芽孢),并創造干燥、低溫、缺氧、缺營養的環境,創造的環境越接近此狀態,所保存的菌種的時間就越長,所以從原理上講,所有菌種都可用這種方法保存, 但需要注意的是,苛刻菌(如流感嗜血桿菌、腦膜炎萘瑟氏菌)等特殊細菌保存時,需-80℃或更低溫度保存,才可以做到更長期的保存。
      3、能用菌種保存管永久保存菌株嗎?
      答:溫度越低,保藏效果越好。從目前的試驗數據及實際保存效果來看,-20℃可保存1-5 年,-80℃或液氮中可保存5-10 年,不同菌種及不同的保存溫度保存時間會有所不同(例如:大腸、沙門等常規細菌-20℃我們目前可以保存到6年)。但需要注意的是所保存的菌種需每年抽檢進行生化特征的鑒定,確定菌株無變異。
      4、菌種保藏時為什么要進行分離純化?
      答:分離純化后才能獲得單一菌株,單一菌株進行菌種保藏才有意義,防止菌種交叉污染和變異,這也是菌種保存的基本原則。
      5、菌種保存管對于平板來說,對挑選菌落個數有要求嗎?還是將整個平板的菌落全部刮入管中?
      答:對于要保存的細菌一般是要進行2-3 次的純化,要保證一個平板上的菌是由單一菌落傳代而來的,所以在細菌保存的過程中,為了保證制備的菌懸液可以達到3-4MCF,是可以將整個平板的的細菌全部刮到管中的,如果平板長的比較滿一般半個平板就夠用,具體用量也根據菌種的不同有所差異,如霉菌、酵母菌在保存時,不適合用濁度法。
      6、對于液體培養基培養的純菌,是否也可以用咱們的菌種保存管?如果可以的話,怎么操作?
      答:是可以用的,如果液體培養基能保證是純菌的話,可以直接離心,棄掉上清,然后把保存管中液體吸進去充分混勻,然后再轉移到菌種保存管中,整個過程要注意無菌操作。不過,一般菌種保存管最好選擇平板菌落進行保存,因為液體培養基中有雜菌是不易觀察出來的。
      7、為什么在菌種保存時,要上下顛倒?為什么不能旋搖?
      答:上下顛倒,可使菌懸液充分混勻,菌株充分、均勻地吸附到小瓷珠上,旋搖不利于菌懸液充分混勻,反而會使菌株全部沉淀于管底。
      8、為什么在使用時要將管內的液體盡可能多的吸出?
      答:吸出液體可避免反復凍融形成的冰晶對菌株的損傷,加快復蘇的過程,因此,要盡可能的將與菌種混勻后的保存液吸凈。而常用的甘油法,在復蘇的過程中需用水浴鍋快速溶解,在此過程中,對菌株傷害較大。
      9、在使用后,菌種保存管的保存環境?需要-80冰箱嗎?
      答:本公司菌種保存管采用的是低溫冷凍保存法,因此,使用后,需放置低溫環境,如-20℃、-80℃或液氮中保存,而且溫度越低,保存效果越好。用戶需根據菌種的保存要求選擇具體保存溫度。
      10、為什么說,如果有條件的話,菌種保存管最好置于-80 冰箱或液氮中?
      答:因為,貯存在-70℃以下低溫中能減少冰晶形成,可極大降低冰晶形成對細菌的傷害,同時可為被保存的菌種創造更低的代謝環境,從而延長細菌保存的時間。
      11、為什么在取用菌株時,操作過程要求快速?
      答:菌種保存復蘇的原則,要求慢凍快融,之所以要求快速,是因為在菌種復蘇的過程中, 長時間的溶解過程會對所保存的菌種造成損傷,而我們經過改良的保存方法最大程度的避免復蘇所造成的影響,但我們還是建議遵循菌種的保存復蘇原則,保證所復蘇菌種的復蘇率。
      12、將菌株反復凍存,到底對菌株有什么影響?
      答:低溫會使菌株細胞內的水分形成冰晶,從而引起細胞結構尤其是細胞膜的損傷。細胞體積大者一般要比較小者對低溫更為敏感,而無細胞壁者則比有細胞壁者敏感。如果放到低溫(不是一般冰箱)進行冷凍時,會產生冰晶,冰晶呈針狀,極易導致細菌的嚴重損傷。用電鏡觀察,可見細菌的核膜上有大量針尖樣小孔,當從低溫下移出并開始升溫時,冰晶又會變大,故反復凍存,會對菌株造成極大損傷。
      13、為什么有時候菌種的保存效果不佳?
      答:1、可能是由于保存后未將保存液吸盡,反復凍融形成冰晶損傷菌株細胞,影響了菌株活性。
      2、確定所保存的菌種是否為對數生長期的菌種,我們建議普通菌種保存為18小時內的新鮮菌種,而霉菌需要待孢子出現后保存其孢子。
      14、該產品能否用于菌種的運送,如果可以在什么條件下運送?
      答:就目前試驗數據而言,我們建議可主要用于普通細菌的短期運送,對于厭氧菌在運送時最好讓其處于厭氧環境下,2-8℃運送不超過5 天。另外需要說明的是如弧菌屬和綠膿桿菌需要常溫運送,其對2-8℃溫度極其敏感。
      編輯:foodec007

       
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