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      離心機沉降系數的測定

      放大字體  縮小字體 發布日期:2011-06-10  來源:生物秀  瀏覽次數:2131
      核心提示: 離心機沉降系數的測定

      沉降系數測定是分析離心機最主要的用途。通常只需要幾十毫克甚至幾十微克樣品,配制成1~2毫升溶液,裝入分析池,以幾小時的分析離心,就可以獲得一系列的樣品離心沉降圖。根據沉降圖可以作樣品所含組分的定性分析,亦可以測定各組分的沉降系數和估計分子大小,作樣品純度檢定和不均一性測定,以組分的相對含量測定。
      1.原理
      沉降系數的測定原理就是在恒定的離心力場下測定樣品顆粒的沉降速度。因為樣品顆粒很小,不能直接看到它們的沉降運動,所以把離心時樣品顆粒的界面移動速度看作是樣品顆粒的平均沉降速度。通常使用Schlieren和吸收光學系統來記錄界面沉降圖。在沉降圖中樣品界面一般表現為一個對稱的峰,峰的最高點代表界面位置。通常沉降系數測量精度為±2%,但是如果面界圖型表現為不對稱峰型,或希 望沉降系數測量精度達到±1%或更小的情況時,按峰的最高點作為界面位置就不夠了這時應該使用二階距法計算界面位置。
      2.沉降系數測定實例
      ⑴樣品:牛血清白蛋白
      ⑵樣品溶液與離心:按0.6%濃度將牛血清白蛋白溶于0.14M NaCl、0.01M磷酸緩沖液中,pH7.0。用12mm厚雙槽分析池,一邊加入溶液一邊加入溶劑,約各0.3ml。分析池與平衡池平衡重量,使平衡池比分析池輕0.5g以內,然后分別裝入分析轉頭。分析轉頭裝于分析離心為什么,關轉動腔,抽真空。開 Schlieren光光源,選擇工作速度一60000轉/分,離心室溫。轉動腔達到真空后離以機開始運轉加速,此時在觀察窗口可以看到離心圖型。達到工作速度后即為恒速離心。待看到樣品峰的尖端后即可以6分 鐘間隔照相,共照6張。照完相即可關機,取出樣品液,清理轉頭和分析池。照相用強反差顯影沖洗后即得Schlieren光路沉降圖形照片。
      ⑶沉降圖象測量:Schlieren沉降圖可以用比長儀,讀數顯微鏡,或投影儀測量。要求測量的橫向量程為6cm,測量精度應優于10μm。通常讀數顯微鏡已能滿足要求。投影儀可以使圖象放大于屏幕上,讀測比較容易,眼睛不易疲勞。測量時把沉降圖象的底片放于測量儀器上,使液面的垂直線與測量儀中的垂直線重合,然后用十字標線依次測量內參孔,液面,界面峰尖,和外參考孔的位置,每個圖象至少讀測三次,取平均值。依次把每個圖象依同樣方法測量,把數據列成表5。
      照相號 x1(mm) x2(mm) x3(mm) x4(mm) (x3-x1)/a log[5.65+(x3-x1)/a]
      1 45.426 37.626 33.807 13.810 0.6125 0.7967
      2 45.640 37.830 33.351 13.420 0.6485 0.7992
      3 45.890 38.070 32.895 13.663 0.6854 0.8017
      4 45.733 37.921 32.163 13.523 0.7161 0.8039
      5 45.802 38.000 31.580 13.593 0.7507 0.8062
      6 46.009 38.211 31.172 13.800 0.7830 0.8084
      (4)沉降系數S的計算:沉降圖測量完,先檢查每一張圖和第六張圖的x2-x1值,二張圖的x2-x1值的差應該小于界面峰位置的測量誤差。實測x2-x1的差值為0.002,說明液面在離心30分鐘內變動為 0.002mm。界面峰在30分鐘內移動距離是第六號圖的x1-x3減第一號圖的x1-x3,是3.208mm,其峰位測量意味著允許為0.03?蓛汝懸好孀儎0.002mm遠小于峰位測量誤差0.03mm,說明離心時沒有發生漏液。
      按a=(x4-x1)/1.7求算光路對分析池的放大倍數,然后按(x3-x1)/a求算界面峰離開內參考孔的實際距離,再按x=5.65+(x3-x1)/a求算界面峰離開旋轉中心的實際距離,再由對數表求算logx植,計算數據亦列于表5中。
      3.離心圖象的分析 
      當離心剛開始時如果見到有快速沉降的峰,幾分鐘內就到達分析池底部,一般多是由于樣品發生部分聚合形成快速沉降的高聚物,如蛋白質樣品液遇到某些變性因素時會部分變性而沉淀。離心達速后樣品的的記心圖象顯示一個對稱的峰形,一般可以認為樣品是離心均一的。但是對樣品的真正均一性還應用其他方法進一步檢測,如電泳,層析等。某些混合樣品偶然亦會給出一個對稱峰的。峰形通常會隨時間而擴展,這是由于樣品擴散的結果。但如果峰形擴展很快,則該樣品可能是多分散性的。如果離心圖象中表現幾個峰,說明樣品中有幾個組分,每一個峰代表相應組分的沉降界面,因此可以測定每一個組分的沉降系數值。根據峰的面積可以測量組分的濃度值。
      有時離心的圖象表現出一個不對稱的峰,這可能是由于下列幾種情況所致。①幾個沉降系數接近的組分峰形重疊,②樣品是多分散性的,其分子量分布不均勻,③某些相互作用強的高分子,其沉降速度對濃度依賴很大,如DNA,多糖分子,若測定于高濃度,在界面區由于濃度變化造成沉降速度不一致而致峰形呈不對稱分布。這類樣品在更大濃度時甚至會形成一非常尖銳的界面,在離心沉降圖中表現成一根垂直線,看不到任何峰形。根據這種圖形測定沉降系數誤差將很大。通常這類樣品應該測定于很稀的濃度,此條件下分子相互作用變小,界面擴展的峰形,才可以測到正確的沉降系數。
      4.樣品的純度和濃度測定
      分析離心機可以測定樣品的純度和濃度,這亦是分析離心用途。通常樣品的離心圖形表現一個對稱峰形時,可認為該樣品是離心均一的。但是在作純度測定時還要注意樣品的測定濃度,應該使樣品測定濃度大于測定方法的靈敏度一百倍以上,測定才有意義。譬如Schlieren光路對該樣品測定靈敏度為 0.1mg/ml,那么該樣品測純度時的濃度應該是90mg/ml。假如選用樣1mg/ml濃度測定,沉降圖形即使表現單一峰,仍不能確定其純度是0%還是99%。如果樣品是多組分的,離心圖中表現幾個峰,根據每個峰的面積與所有峰的總面積的比值可以得到每個組分的相對濃度值。在計算時應該考慮輻射稀釋效應,即把各個組分的面積值根據其所在位置用輻射稀釋公式校正到液面處的值,然后計算相對。還要注意這樣的濃度估測是建立在各個組分具有相同的折射率比值的假設基礎上的。根據峰形面積結合該組分的濃度與折射率比值和儀器常數還可以計算該組掃的絕對濃度值。
      5.帶狀沉降法
      帶狀沉降法類似于速率區帶離心法。方法使用合成界面池,在池中預先加入0.55ml的1M NaCl溶液,然后地2000轉/分轉速下鋪上0.01ml樣品液,然后加速到30000轉/分,用吸收光路記錄樣品沉降圖形。由于NaNl向樣,品帶擴散形成一密度梯度區,可以穩定沉降的樣品區帶。樣品中如果有多個沉降系數不同的組分,它們將依各自的沉降速度呈區帶沉降。利用這個方法可以檢定樣品純度,估測組成的相對含量和沉降系數。適用于微量的核酸和病毒樣品的分析測定。
       
      編輯:songjiajie2010

       
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      關鍵詞: 離心機 沉降系數
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