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      【全面解析】菌落總數檢測及新手棘手問題

      放大字體  縮小字體 發布日期:2021-09-08  瀏覽次數:456
      核心提示:菌落總數所使用標準食品企業一般會用到的兩個做菌落總數的標準。(當然還有其他標準)食品國家標準:GB 4789.2-2016 《食品安全國
       菌落總數所使用標準

       

      食品企業一般會用到的兩個做菌落總數的標準。(當然還有其他標準)

       

      食品國家標準:

      GB 4789.2-2016 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》

      生產用水:

      GB-T5750.12-2006 《生活飲用水標準檢驗方法微生物指標》

       

      以這兩個標準來說,它們的檢測方法是差不多,主要區別在于培養基的不同和樣品的狀態不同(食品中有固態和液態,生活飲用水只有液態)。食品的培養基是使用PCA,生產用水的使用NA。

       

      2
      培養基成分

       

      PCA(平板計數瓊脂培養基)

      胰蛋白胨      5.0g

      酵母浸膏      2.5g

      葡萄糖         1.0g

      瓊脂           15.0g

      蒸餾水        1000mL

      注:胰蛋白胨提供碳源和氮源;酵母浸粉提供B族維生素;葡萄糖提供能源;瓊脂是培養基的凝固劑。

       

      NA(營養瓊脂)

      蛋白胨        10g

      牛肉膏        3g

      氯化鈉        5g

      瓊脂          14g(標準10g-20g)

      蒸餾水        1000mL

      注:蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源;氯化鈉能維持均衡的滲透壓;瓊脂是培養基的凝固劑。

       

      3
      檢測方法

      4
      操作注意細節

       

      1 菌落總數是比較常規的微生物檢測項目,也是比較容易做的一個微生物檢測方法,主要注意無菌操作,與稀釋液均勻性。

       

      2 在空白出現菌落的時候需要去分析哪一步出現問題,人機料法環。當然空白出現菌落的時候,那么該批次的菌落總數數據都作廢處理。在制樣和做樣的時候需要在百級的環境(百級的潔凈工作臺)下進行。

       

      3 稀釋液的均勻性,這個會影響結果,剛開始的時候可能會造成同一梯度的兩個結果相差有點遠,這個是因為做的時候沒有把稀釋液均勻。如果前后兩個梯度沒有梯度性,那么就是在做稀釋做不好。這個都是靠多做,技術才會提高。(當然還有一種情況,樣品是中添加了抑菌物質,這樣沒有梯度性。)

       

      5
      計數

       

      1  可用肉眼觀察,必要時用放大鏡或菌落計數器,記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位(colony-formingunits , CFU )表示。

       

      2  選取菌落數在 30CFU~300CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低于 30CFU的平板記錄具體菌落數,大于 300CFU 的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。

       

      3  其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數;若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個平板后乘以2,代表一個平板菌落數。(這個是很多新手會問的一個問題)

       

      4  當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時,則將每條單鏈作為一個菌落計數。

       

      計數(標準中介紹)

      1  若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內,計算兩個平板菌落數的平均值,再將平均值乘以相應稀釋倍數,作為每 g ( mL )樣品中菌落總數結果。

       

      2  若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時,按式( 1 )計算:

      3  若所有稀釋度的平板上菌落數均大于 300CFU,則對稀釋度最高的平板進行計數,其他平板可記錄為多不可計,結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。

       

      4  若所有稀釋度的平板菌落數均小于 30CFU,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。

       

      5  若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于 1 乘以最低稀釋倍數計算。

       

      6  若所有稀釋度的平板菌落數均不在 30CFU~300CFU 之間,其中一部分小于 30CFU 或大于300CFU 時,則以最接近 30CFU 或 300CFU 的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。

       

      6
      菌落總數的問題(是一些新手問的問題)

       

      1.有新人可能會拿著菌落總數的平板去問別人這是什么菌?

      答:這是看不出來的,菌落總數只能檢測出樣品衛生情況,一個樣品的細菌數量,不能驗證出什么菌。這是一個不應該犯的誤區。

       

      2.若所有稀釋度的平板菌落數均不在 30CFU~300CFU 之間,其中一部分小于 30CFU 或大于300CFU 時。就會有人不知道怎么去判定那個梯度更接近30-300。

      舉例:一個梯度:28/28;另梯度:305/305,那么那個數據更接近呢?

      兩個方法(網友提供):

      a、按標準字面意思直接做差比較后再乘以稀釋倍數:28-30=-2,他們相差2;305-300=5,他們相差5。2比5要小,那么采取28相應的梯度再乘以稀釋倍數;

      b、恢復為同稀釋度做差比較:把兩個梯度換算成同一個梯度,一般把28換算成280。280-300=-20,相差20;305-300=5,相差5。20比5要大,那么采取305相應的梯度。

      (個人意見:我是更偏向于第二種,因為要在同一個梯度上做比較才能體現出數據的可靠性,同時我偏向采用前一個梯度的數字,那么這個數值可以減少一步步驟帶來的誤差,數據可能更加接近樣品的情況)

       

      3.有時候會出現這么一個情況,最低稀釋梯度中一個平板出現1個菌落,另一個無菌落生長。那么結果怎么出呢?

      答:(以固態為例子)在過去也有討論過,有人認為報告寫5,也有認為報告寫<10(比較兩個平板均無菌落生長的時候報<10)這個兩個報告方法其實也是可以采用。(我是采用第一種;個人理解不長報告<10,那么長了也報<10嗎?不太合理)

       

      4.在做菌落總數的時候,有時候會樣品和菌落分不清的(老前輩不會這樣),那么如何區分兩種物質呢?

      答:在培養基中添加TTC(一般2%濃度1mL加到400mL的培養基中,TTC的濃度不要過高,會有抑制作用)。TTC的原理:TTC和活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶反應,生成紅色的甲月贊。那么生長的菌落會變成紅色,這樣就可以區分菌落與樣品。

      還有一個方法:4℃冷藏保存一個樣品和培養基混勻的平板做對照,觀察菌落的形態特征,老前輩們基本靠這個去區分的。

       

      5、菌落總數計數包括霉菌嗎?

      答:菌落總數的概念是這么規定的,食品檢樣經過處理,在一定條件下(如培養基、培養溫度、培養時間等)培養后,所得每g(mL)檢樣中形成的微生物菌落總數。所以也包括在PCA上生長的霉菌和酵母等微生物。

       

      6、培養基溫度不好控制?

      答:前提是培養基滅菌好了放在水浴鍋內保溫46攝氏度。使用時一個同事在外面把培養基從水浴鍋拿到傳遞窗,培養基表面噴酒精殺菌,然后開啟傳遞窗的紫外燈5min(這一步是對培養基表面殺菌,減少對潔凈房的污染)。里面的同事5min之后拿起來放在手心人體不覺燙手,這樣的溫度最佳倒平板。(注意:倒平板的速度要快,一次最好只拿一瓶,避免培養基凝固)

       

      7、有些朋友不理解菌落總數的單位CFU的意思。

      答:CFU為Colony-Forming Units英文縮寫,其含義是形成菌落的菌落個數,不等于細菌個數。(比如兩個相同的細菌靠得很近或貼在一起,那么經過培養這兩個細菌將會形成一個菌落,此時就是2個細菌,1CFU)。菌落總數往往采用的是平板計數法,經過培養后我們數出平板上所生長出的菌落個數,從而計算出每毫升或每克待檢樣品中可以培養出多少個菌落,于是以CFU/ml或CFU/g報告之。

       

      8、菌落超標的危害。

      答:食品的菌落總數嚴重超標,說明其產品的衛生狀況達不到基本的衛生要求,將會破壞食品的營養成分,加速食品的腐敗變質,使食品失去食用價值。消費者食用微生物超標嚴重的食品,很容易患痢疾等腸道疾病,可能引起嘔吐、腹瀉等癥狀,危害人體健康安全。

      但需要強調的是,菌落總數和致病菌有本質區別,菌落總數包括致病菌和有益菌,對人體有損害的主要是其中的致病菌,這些病菌會破壞腸道里正常的菌落環境,一部分可能在腸道被殺滅,一部分會留在身體里引起腹瀉、損傷肝臟等身體器官,而有益菌包括酸奶中常被提起的乳酸菌等。但菌落總數超標也意味著致病菌超標的機會增大,增加危害人體健康的幾率。

       

      9、培養后的培養基出現干裂情況。

      答:干裂是由于培養基里面的水份缺失導致,所以當出現干裂情況,先要觀察干裂平板的數量和位置?词欠袷桥囵B箱內部溫度不穩定導致(一般平皿一疊可以放置六個,同時要注意每疊之間需要保留一點間隙讓其通風);排除儀器的原因之后,看是培養基否倒得太。ǔ鯇W者可以拿三角瓶裝水進行練習);還有其他原因,其實在出現干裂的情況下,結果是無效的(除非干裂情況不嚴重)。排查出問題所在,可以避免我們下次再犯錯。

       

      10、培養基的配置。

      答:培養基的包裝上(標準上)都會寫著先煮熱溶解再分裝,那么是不是一定要煮熱溶解呢?首先瓶子上的配置方法是直接配置一升的PCA,這里是必須要煮熱溶解(防止不均勻,使得部分培養基不凝固)。

      其實配置培養基有兩個方法:第一個:用一個大容器配置培養基,然后加水煮熱溶解(注意攪拌,防止燒焦),待溶解完成之后進行分裝(這里需要注意安全),再去滅菌。第二個方法就是使用500mL三角瓶(其他容器也可以)配置300ml的培養基,加水稍微溶解(此步不需要加熱),再拿去滅菌。

      編輯:songjiajie2010

       
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