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      【收藏】微生物實驗室的菌種鑒定小結

      放大字體  縮小字體 發布日期:2021-10-11  瀏覽次數:127
      核心提示:微生物檢驗過程中檢出的微生物應該進行微生物鑒定,雖然藥典里明確了鑒定到什么水平的標準和一些基礎內容操作方法。但是因為實驗
       微生物檢驗過程中檢出的微生物應該進行微生物鑒定,雖然藥典里明確了鑒定到什么水平的標準和一些基礎內容操作方法。但是因為實驗室能力有限,很多實驗室要么消極抵抗要么稀里糊涂的要么完全委外。

       

      其實我們一般微生物實驗室自己還是可以做一些工作,特別是細菌的鑒定。再就是菌種鑒定時,不是直接拿來就鑒定,需要一些預先做一些處理或判斷,F將一些基礎知識進行總結如下:

       

      一、相關定義

       

      1、生理生化鑒定:根據微生物對各種生理條件(溫度、pH、氧氣、滲透壓)、生化指標(唯一碳氮源、抗生素、酶、鹽堿性)代謝反應進行分析,并將結果轉化成軟件可以識別的數據,進行聚類分析,與已知的參比菌株數據庫進行比較,最終對未知菌進行鑒定的一種技術。

       

      2、革蘭氏染色:系細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法,染色后細菌與環境形成鮮明對比,可以清楚地觀察到細菌的形態、排列及某些結構特征,而用以分類鑒定。

       

      3、平板劃線法:系指把雜菌樣品通過在平板表面劃線稀釋而獲得單菌落的方法。

       

      4、氧化酶試驗:氧化酶不直接與氧化酶試劑起反應,而是先使細胞色素C氧化,然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化,產生顏色反應而進行的試驗,用于區分不發酵的革蘭陰性桿菌(氧化酶陽性)和腸道菌(氧化酶陰性)。

       

      5、觸酶試驗:大多需氧和兼性厭氧菌均產生過氧化氫酶,但鏈球菌屬陰性,故常用此試驗來鑒定,用于區分葡萄球菌(過氧化氫酶陽性)和鏈球菌(過氧化氫酶陰性)。

       

      6、凝固酶試驗:用于區分凝固酶陰性葡萄球菌(可推測為非致病性)和凝固酶陽性葡萄球菌(很可能為致病性)。

       

      二、工作程序

       

      1、微生物鑒定程序

       

      微生物鑒定的基本程序包括分離純化和鑒定,鑒定時一般先將待檢菌進行初步的分類。鑒定的方法有表型微生物鑒定和基因型微生物鑒定,根據所需要達到的鑒定水平選擇鑒定方法。目前實驗室室進行表型微生物鑒定后可以用API試劑條進行或其他等效的試劑條進行菌種鑒定,如API試劑條鑒定不能滿足要求時采取委外鑒定。

       

      注:為了控制成本,可以自己進行鑒定,不具備能力時再委外。API鑒定用的試劑條的效期有限,需要注意效期或跟供應商做好溝通備貨。

       

      1.1 待檢菌的分離與純化

       

      微生物鑒定的第一步是待檢培養物的分離純化,最常用的分離純化方法是挑去待檢菌的純培養物(單個菌落),必要時可進一步進行純培養,為表型鑒定和隨后的鑒定程序提供足夠量的菌體。從藥物原材料、制藥用水、生產環境、中間產品和最終產品的樣品中檢出的受損微生物,經分離純化程序使其由不利生存易產生變化的狀態變為在營養富集和最佳培養溫度條件下生存的穩定狀態,以保證鑒定結果的準確性,具體詳見表1。

       

      表1待檢菌的分離與純化明細表

       

      1.1.1 平板劃線法

       

      平板劃線方法一般通過連續畫蛇形曲線或四區劃線方法進行。四區劃線具體步驟如下:先在平皿上做好標識,然后在選擇所獲得的新鮮菌種進行劃線;左手持無菌平板,拇指和食指控制皿蓋,其余指控制皿底,打開皿蓋,用接種環在皿上進行劃線,一區要連續緊密的幾根平行線(如果菌量過多可以更換接種環),二區緊著著一區的最后一根線帶出來,劃幾根平行線,然后三區、四區同樣的操作,四區應盡量避免接觸到菌落密集區,影響單菌落的形成;最后再選擇適宜的溫度進行培養。

       

       

       

      1.1 .2 稀釋倒平板法

       

      首先把微生物懸液作一系列的稀釋(如1:10、1:100、1:1000、1:10000),然后分別取不同稀釋液少許,與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養基混合,搖勻后,傾入滅過菌的培養皿中,待瓊脂凝固后,制成可能含菌的瓊脂平板,保溫培養一定時間即可出現菌落。

       

      如果稀釋得當,在平板表面或瓊脂培養基中就可出現分散的單個菌落,這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落,或重復以上操作數次,便可得到純培養。

       

      1.1.3 涂布平板法

       

      因為將微生物懸液先加到較燙的培養基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡,且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長,因此在微生物學研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。

       

      其做法是先將已熔化的培養基倒入無菌平皿,制成無菌平板,冷卻凝固后,將一定量的微生物懸液滴加在平板表面,再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面,經培養后挑取單個菌落。

       

       

      1.2 初篩實驗

       

      常規的微生物鑒定,一般要先進行初篩試驗確定待檢菌的基本微生物特征,將待檢菌進行初步分類。常見的初篩試驗包括革蘭氏染色、芽孢染色、鏡檢觀察染色結果和細胞形態、重要的生化反應等。

       

      1.2.1 革蘭氏染色

       

      原理:檢查細菌細胞壁的滲透性,染色前所有細胞是透明的,結晶紫著色后用碘增加染料與菌體結合,乙醇從G(-)菌體洗脫結晶紫,用番紅液復染,革蘭氏陰性菌呈粉紅色,革蘭氏陽性菌呈藍紫色。

       

      染色步驟:一般按照染色液說明書規定進行染色,如說明書無明確說明時按以下步驟進行染色。結晶紫初染,在載玻片上滴一小滴純化水,用灼燒過的接種針挑取少量細菌,置載玻片的水滴中與水混合并涂抹開,涂抹要均勻平坦,涂抹后直徑約為1 cm的薄層。

       

      將載玻片在火焰上方快速來回通過一兩次,以載玻片的加熱面接觸手背皮膚,不覺過燙為佳,待冷卻后再在火焰上方來回通過一兩次,再冷卻,重復操作直到薄層干燥為止;在制好的片上滴一滴草酸銨結晶紫,染色1 min后用水洗;碘液媒染,加碘液一滴,作用1 min后用水沖洗,用過濾紙吸干;乙醇脫色,用95%乙醇脫色,脫色時間大概為30 s。水洗后用過濾紙吸干;番紅復染,滴加0.5%的番紅染色液一滴,染色10~30 s后,用自來水沖洗。

       

      鏡檢:先低倍鏡,再高倍鏡,最后油鏡觀察,觀察菌落形態與菌落顏色,菌落呈紅色即革蘭氏陰性菌,呈藍紫色為革蘭氏陽性菌。

       

      1.2.2 芽孢染色

       

      一般按照染色液使用說明進行芽孢染色。如無明確說明時按以下步驟進行芽孢染色。涂片,先在載玻片上滴一滴純化水,用接種環灼燒過的接種針挑取少量細菌,置載玻片的水滴中與水混合并涂抹開,涂抹要均勻平坦,涂抹后直徑約為1 cm的薄層。

       

      干燥固定,將載玻片在火焰上方快速來回通過一兩次,以載玻片的加熱面接觸手背皮膚,不覺過燙為佳,待冷卻后再在火焰上方來回通過一兩次,再冷卻,重復操作直到薄層干燥為止?兹妇G覆蓋,用木夾夾住載玻片一端,加數滴5%孔雀綠染液覆蓋涂片,在微火上加熱至染料冒蒸汽并開始計時,維持5min。

       

      沖洗,待玻片冷卻后,用緩流自來水沖洗載玻片背面,直至流出的水無色為止。復染,用0.5%番紅染液覆蓋玻片,保持3min。  水洗干燥,用緩流自來水沖洗載玻片背面,直至流出的水無色為止,使其自然干燥。鏡檢,觀察菌落是否含有芽孢。

       

      1.2.3 氧化酶試驗(革蘭氏陰性桿菌)

       

      革蘭氏陰性菌,做氧化酶試驗。取將待檢菌落于無菌的濾紙片上,滴加一滴氧化酶試劑,反應3分鐘,出現紫色為陽性,反之為陰性。

       

      1.2.4 非發酵菌鑒定

       

      接種前把OF培養基在沸水浴溶解,在室溫冷卻后,每試驗分裝 2個安培的固體OF培養基,利用接種針挑單個菌落,穿刺到OF培養基(深度約1cm.),把其中一個已接種好的安培(OF.F),用石蠟油覆蓋1cm. 把兩個安培蓋上塑料帽,培養35-37°C , 24 – 48小時。

       

      結果判定:兩瓶均為黃色,則為發酵菌,則為發酵菌,兩管培養基一瓶顯示綠色F-,一瓶顯示黃色O+。

       

      1.2.5 觸酶試驗(革蘭氏陽性菌)

       

      玻片法:挑取被撿菌落于玻片上,直接用試劑進行乳化,5s內產生氣泡即為陽性結果,反之為陰性。

       

      1.3 表型微生物鑒定

       

      表型微生物鑒定依據表型特征的表達來區分不同微生物間的差異,是經典的微生物分類鑒定法,以微生物細胞的形態和習性表型為主要指標,通過比較微生物的菌落形態、理化特征和特征化學成分與典型微生物的差異進行鑒別。微生物分類中使用的表型特征如表2。

       

      表2 微生物分類中使用的表性特征表

       

      1.4.API試劑條的使用

       

      1.4.1API試劑條的選條標準

       

      根據API系統選條標準,來選擇適合的API鑒別條來鑒別。如革蘭氏陽性球菌:觸酶試驗陽性為葡萄球菌用API STAPH鑒別,觸酶試驗陰性為鏈球菌用API 20 STREP鑒別。

       

      1.4.2API試劑條的操作步驟

       

      1.4.2.1分離單個菌落:用一次性無菌接種環或已滅菌棉簽挑單個可疑菌落,盡量避免使用高度選擇性培養基。

       

      1.4.2.2安瓿瓶的開啟:蓋上安瓿開啟器,用手垂直握住安瓿瓶(白色塑料瓶蓋朝上),盡量將瓶蓋壓下,用大拇指頂住瓶蓋上斜面部分,同時用拇指向外加壓。

       

      1.4.2.3 制菌懸液:將挑取的單個菌落置于含0.85%氯化鈉溶液或懸浮培養基5ml的安培瓶,混勻。

       

      1.4.2.4測定菌懸液濁度

       

      1.4.2.5菌液的加入:將5ml無菌水放入培養盒以提供濕潤的培養環境,同時放入試紙條,將菌液接種到小管或小管及小杯(CIT, VP和 GEL),利用石臘油覆蓋指定的生化孔 (有劃線的孔ADH ,ODC, H2S 和URE),蓋上培養蓋。

       

      1.4.2.5培養:把試紙條放進培養箱內,利用指定溫度及時間進行培養(如API20E : 35 ~ 37℃,18-24 小時)。

       

      1.4.2.6附加試劑加入:培養結束后,按操作說明書規定,將附加試劑加進適當小孔內。

       

      1.4.2.7結果分析:登錄APIWEB,試紙條上每三個小孔(小管)作為一組,記分分別為1、2、4分,將試紙條的顯色情況進行輸入,進行結果對比判讀。

       

      1.4.2.8結果判讀原理

       

      生化結果組合跟資料庫內的典型條目(Taxa)作出比較,經計算後,鑒定百比率(%Id)=機會率,指示出不同菌類的比較,T值指示出在同一個菌類的相似程度。依據T值及%Id的組合,作出評語:

       

      極好的鑒定結果          %Id >99.9及T>0.75  
      很好的鑒定結果          %Id >99.0及T>0.50  
      好的鑒定結果              %Id >90.0及T>0.25  
      可以接受的鑒定結果          %Id >80.0及T>0  
      可疑的生化譜           N/A

      來源:網絡整理

      編輯:songjiajie2010

       
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