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      細胞轉染操作方法

      放大字體  縮小字體 發布日期:2012-09-01  來源:生物在線  瀏覽次數:982
      核心提示: 細胞轉染操作方法

      轉染 ,是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入,轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例;化學介導方法很多,如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術;生物介導方法,有較為原始的原生質體轉染,和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。
       
      理想細胞轉染方法,應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優點。病毒介導的轉染技術,是目前轉染效率最高的方法,同時具有細胞毒性很低的優勢。但是,病毒轉染方法的準備程序復雜,常常對細胞類型有很強的選擇性,在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法,則各有其特點。
       
      需要指出的一點,無論采用哪種轉染技術,要獲得最優的轉染結果,可能都需要對轉染條件進行優化。影響轉染效率的因素很多,從細胞類型、細胞培養條件和細胞生長狀態,到轉染方法的操作細節,都需要考慮。
       
      一、細胞傳代
       
      1. 試驗準備:200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),酒精棉球,廢液缸,試管架,微量移液器,記號筆,培養皿,離心管。
       
      2. 棄掉培養皿中的培養基,用1ml的PBS溶液洗滌兩次。
       
      3. 用Tip頭加入1ml Trypsin液,消化1分鐘(37℃,5%CO2 )。用手輕拍培養瓶壁,觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。
       
      4. 加入1ml的含血清培養基終止反應。
       
      5. 用Tip頭多次吹吸,使細胞完全分散開。
       
      6. 將培養液裝入離心管中,1000rpm離心5min。
       
      7. 用培養液重懸細胞,細胞計數后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養皿。
       
      8. 將合適體積完全培養液加入離心管中,混勻細胞后輕輕加入培養皿中,使其均勻分布。
       
      9. 將培養皿轉入CO2培養箱中培養,第二天轉染。
       
      二、細胞轉染
       
      1. 轉染試劑的準備
       
      ① 將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。
       
      ② 震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩。
       
      2. 選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質體體積:DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉染試劑,再次震蕩。
       
      3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。
       
      4. 吸去培養板中的培養基,用PBS或者無血清培養基清洗一次。
       
      5. 加入混合液,將細胞放回培養箱中培養一個小時。
       
      6. 到時后,根據細胞種類決定是否移除混合液,之后加入完全培養基繼續培養24-48小時。
       
      三、第二次細胞傳代
       
      1. 在轉染后24小時,觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。
       
      2. 再次進行細胞傳代,按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養皿將細胞重新轉入培養皿中。
       
      3. 在正常條件下培養24小時后按照染色要求條件固定。
       
       
      編輯:songjiajie2010

       
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      關鍵詞: 細胞轉染
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